液相色谱仪原理_液相色谱仪能测什么?HPLC操作步骤[专题]

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液相色谱仪

液相色谱仪原理_液相色谱仪能测什么?HPLC操作步骤[专题]

本文主题词：液相色谱仪,液相色谱仪原理,液相色谱仪能干什么,高效液相色谱仪操作步骤

一、高效液相色谱仪原理：

高效液相色谱法的原理是在原始的经典色谱法基础上面引用气象色谱的理论，把原来的流动性改变为最高压力可达到4.9′107Pa。色谱柱则是用特殊的方式用小颗粒装填而成。造成的结果就是色谱柱的柱效远远高于原始的经典液相色谱。并且它柱子使用后还能具有高度灵敏度检测器。能够对流出来的分析物进行连续检测。

通俗来讲就是：

多年前大学老师讲的，至今认为是最形象的对“色谱”的描述—讲一群女孩子去逛街，街上店铺林立，但是每个女孩子都有自己不同的喜好于是有的进了这家，有的进了那家，最后大家越走越分散，所以有的先走出这条街，有的后走出来—女孩子指化合物，这条街是色谱柱。店铺是固定相，推着化合物走得是流动相，提供动力的是泵，最后站在街尾数人数认人的是检测器。认人带着照片啥的是标准品，认出来走到倒数第二个的女孩就是你朝思暮想的那位。就可以定义或定量分析了。这就是高效液相色谱仪的原理

二、高效液相色谱仪能测什么？

高效液相色谱仪是利用混合物各组分在固定相和流动相中溶解、分配或吸附等化学作用性能的差异，使各组分在作相对运动的两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。高效液相色谱仪在食品分析、环境分析、生命科学、医学检验和无机分析等领域得到广泛使用。一般来说，80%～85% 的有机物原则上可采用高效液相色谱仪分析。

一、在食品分析中的应用：

1、食品营养成分分析：

蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸和苹果酸等）、有机胺和矿物质等分析。

2、食品添加剂分析：

甜味剂、防腐剂、着色剂（柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄和亮蓝等）和抗氧化剂等分析。

3、食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素和大肠杆菌毒素等）、微量元素和多环芳烃等分析。

二、在环境分析中的应用：

多环芳烃（特别是稠环芳烃）和农药残留（氨基甲酸脂类，反相色谱）等分析。

三、在生命科学中的应用：

1、低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类和维生素等分析。

2、高分子量物质：多肽、核糖核酸、酶（胰岛素、激素、细胞色素和干扰素等）和蛋白质等分析。

四、在医学检验中的应用：1、合成药物：抗生素、抗忧郁药物和黄胺类药等分析。2、天然药物生物碱：吲哚碱、颠茄碱和强心甙等分析。五、在无机分析中的应用：阳、阴离子等分析。这就是高效液相色谱仪能测什么？

三、高效液相色谱仪操作步骤：

1、开机设定参数（检测波长、流速），更换所需流动相，检查色谱柱是否正确。

2、排液置换管路中流动相，冲洗进样阀，洗好进样针。

3、冲洗色谱柱进行平衡，其间可提前进行样品的处理，样品信息的注册。

4、平衡好以后进空白试验，排除系统污染。

5、柱子稳定好以后进样，等待运行结束（其间清洗进样针），积分计算，出具报告。

详细操作步骤如下：

1、开机操作：

（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开Bootp Server（一般启动时已打开）；

（2）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开On line）；

（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；

（4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；

（5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。

2、先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；

3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；

4、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；

5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；

6、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭D灯、W灯；

7、关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；

8、使用者须认真履行仪器使用登记制度，不要擅自拆卸仪器。

流动相：

1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；

2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；

3、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；

A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。

样品：

1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；

2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；

手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；

色谱柱：

1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；

2、使用符合要求的流动相；

3、使用保护柱；

4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。

5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；

6、不要高压冲洗柱子；

7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；

4、高效液相色谱仪注意事项：

1）流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2）柱子是非常脆弱的，*次做的方法，先不要让液体过柱子。

3）所有过柱子的液体均需严格地过滤。

4）压力不能太大，zui好不要超过2000psi

1.使用“保护柱”，能够延长色谱柱的使用寿命。简单的说，“保护柱”即是很短的色谱柱，填装和所使用液相色谱柱相同的填料。正确使用装在液相色谱柱前面的“保护柱”，可以阻拦一些容易损坏液相色谱柱的物质。而达到延长柱子寿命的效果。如果使用“保护柱”不当会造成反效果。因为都在保护柱使用过程中。如污染达到一定程度而没有及时更换，累积的杂物很可能会冲入色谱柱中，反而会造成色谱柱损坏。因此。使用“保护柱”时，zui重要的是要知道什么时候该保护柱。该换的时候就必须要立即更换。

2.选择高品质的柱子，并注意使用方法；可以延长柱子的使用寿命。一般认为同一厂牌、同一型号的柱子之间的品质都相同，对品质管理很严格的厂家而言，这种说法是成立的。但如果厂家质管理不够严格，即使是同一批号的新柱子之间的品质也有差异。所以，选用柱子时必须选择管理严格的高品质柱子，我们知道，任何柱子使用过后都会产生变化。尤其如在强酸或强碱条件下使用，柱子更易产生变化。因此，尽量选用pH适用范围大的柱子。在开发信分析方法时，许多专家建议不要使用旧柱子。因柱子一经使用。柱性会改变；如此一来，使用旧柱子开发出来的新分析方法，很可能在使用同厂牌的新柱子分析时。发生无法达到预定效果的情况。总的说。开发新分析方法时使用品质好的新主子；并且一直柱子应该使用在一种分析方法上；则柱子寿命可以延长。

3.定期冲洗柱子可以延长柱子使用寿命。我们知道柱子使用一段时间后总会有一些杂质累积在柱内。这些杂质不会随着流动相出来，自然会逐渐影响柱子的品质。这些杂质在后来的分析谱图上出现。而造成出现怪峰、基线不平等现象。简单的解决方法是用较强的流动相冲洗。zui好是在每次分析某一产品完成后冲洗。如果分析时使用缓冲剂时，zui好用水来取代缓冲剂。先使用有机和水的混合溶液为流动冲洗缓冲剂。接着再用100%有机溶剂冲洗。如果不先用有机和水的混合溶液冲洗，而直接用100%有机溶剂冲洗的话，缓冲剂很可能会沉淀出来，而损坏柱子的品质。使用10-20倍柱体积的量来冲洗基本就足够了。专家建议zui好将100%有机溶剂冲洗的条件加在分析实验程序完毕的zui后，如此一来每天在开机前都会用100%有机溶剂冲洗。一般硅胶柱可以反冲洗处理，即是在将冲洗前将柱子倒反接后再冲洗。打算使用反冲洗处理前，zui好先参考柱子的保养说明书。所以要真正保护柱子，使用柱子的寿命延长，zui好是使用“保护柱”和定期冲洗柱子。

五、高效液相色谱仪于超高效液相色谱仪区别：

高效液相是两种或四种流动相在泵前进行混合，通过比例阀，比例阀是通过时间来控制比例的，容易产生气泡，所以一般都加脱气包或脱气机，例如waters的ACQUITY系列产品，安捷伦的1200,1260，而超高液相两种或四种流动相直接通过高压泵控制比例在泵后混合，可以不需要脱气包或脱气机，因为压力很高，混合时也不产生气泡，同样的超高液相使用的色谱柱粒径更小，高效液相色谱一般使用色谱柱填料粒径在5μm，3.2μm，很少使用1.7μm的色谱柱，而超高液相可以使用1.7μm内径的填料色谱柱，色谱柱长也可以增加到250mm，减少分离时间，使分析时间大大的降低。

六、高效液相色谱仪组成和分类：

高效液相色谱仪的组成及分类
1. 高压输液系统
贮液装置、高压输液泵、过滤器、脱气装置等
1.1. 贮液器：贮液器用于存放溶剂。溶剂必须很纯，贮液器材料要耐腐蚀，对溶剂呈惰性。贮液器应配有溶剂过滤器，以防止活动相中的颗粒进进泵内。溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成，空隙大小一般为2mm。
1.2. 脱气装置：脱气的目的是为了防止活动相从高压柱内流出时，开释出气泡进进检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检测。
1.3. 高压输液泵高压输液泵是高效液相色谱仪的重要部件，是驱动溶剂和样品通过色谱柱和检测系统的高压源，其性能好坏直接影响分析结果的可靠性。
对高压泵的基本要求是：
①流量稳定；②输出压力高，zui高输出压力为50Mpa；③流量范围宽，可在0.01～10ml／min范围任选。④耐酸、碱、缓冲液腐蚀。⑤压力波动小。
1.2. 梯度洗脱装置梯度洗脱是利用两种或两种以上的溶剂，按照一定时间程序连续或阶段地改变配比浓度，以达到改变活动相极性、离子强度或pH值，从而进步洗脱能力，改善分离的一种有效方法。当一个样品混合物的容量因子是范围很宽，用等度洗脱时间太长，且后出的峰形扁平不便检测时，用梯度洗脱可以改善峰形、并缩短分离时间。HPLC的梯度洗脱与GC的程序升温相似，可以缩短分析时间，进步分离效果。使所有的峰都处于zui佳分离状态，而且峰形尖而窄。
2 进样器
进样器一般要求密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力和流量波动小，并便于实现自动化。
高压进样阀是目前广泛采用的一种方式。阀的种类很多，有六通阀、四通阀，双路阀等。以六通进样阀zui为常用。
3.分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和活动相。色谱柱是其核心部分，柱应具备耐高压、耐腐蚀、抗氧化、密封不漏液和柱内死体积小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱寿命长的要求。通常采用优质不锈钢管制成。
色谱柱按内径不同可分为常规柱、快速柱和微量柱三类。
常规分析柱柱长一般为10~25cm，内径4 ~ 5mm，固定相颗粒直径为 5 ~ 10 mm。为了保护分析柱不受污染，一般在分析柱前加一短柱，约数厘米长，称为保护柱。
（微量分析柱内径小于l mm，凝胶色谱往内径3～12 mm，制备往内径较大，可达25 mm以上。）
4 检测系统
检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。
4. 1. 紫外可见吸收检测器（ultraviolet－visible detector，UVD）
紫外可见吸收检测器（UVD）是HPLC中应用zui广泛的检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点是灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似，实际上就是装有活动地的紫外可见光度计。
（1）紫外吸收检测器：
紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽（190nm～800nm）。它有两个流通池，一个作参比，一个作丈量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进进丈量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。
局限：活动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做活动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长
（2）光电二极管阵列检测器（photodiode array detector， PDAD）：
也称快速扫描紫外可见分光检测器，是一种新型的光吸收式检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再进射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，得到吸收值(A)是保存时间(tR)和波长(l)函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有zui佳选择性和灵敏度的波长。